荧光分光光度计激发波长的选择
荧光分光光度计激发波长的选择
该怎么确定激发波长与发射波长呢?对许多仪器初学者来说,这是个令人感到困扰的问题。如果仪器有三维扫描功能,那就比较简单,放样品进去,按照说明书要求做三维荧光扫描,可以很方便地确定出合适的激发波长与发射波长。如果仪器没有三维扫描功能,一般的方法如下。
首先,将仪器的激发波长(λex)先设定为200nm,然后进行发射(EM)模式扫描,发射波长(λem)扫描范围暂设定为210-800nm,记录所有出现的峰值波长;改变激发波长(λex)后再扫描,如第二次发射图谱中的某个(或某些)峰的位置没有位移(或位移很少),一般来说这个(或这些)峰就是荧光峰;因为荧光峰的位置是不随激发波长的改变而改变的,仅是峰高(或峰面积)发生改变。
然后,将确定的荧光峰的波长作为发射波长(λex)固定下来,再做激发波长(EX)的扫描,激发波长的范围要小于发射波长;如果仅出一个激发峰则很简单确立下来,再将这个波长固定下来重新做真正的发射波长(EM)扫描,可以得到具有良好信噪噪比的结果;如果做激发波长(EX)扫描后出现几个峰,则根据经验来选择,一般应选择峰形、高度适合且有一定带宽的峰作为激发波长。也可以参考荧光光谱的特性——激发光谱与发射光谱呈镜像的特点来确定激发波长。
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